SSR研究进展 11月集锦（一）

发稿时间：2019-12-06来源：天昊生物

1、基于转录组测序的缺须盆唇鱼微卫星标记特征分析

作者：任芳，马秀慧

作者单位：1. 贵州大学动物科学院 2. 贵州大学特种水产动物研究所 3. 高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室

出版日期：2019-11-4

缺须盆唇鱼(Placocheilus cryptonemus)是云南省怒江流域特有的一种高原经济鱼类，主要分布于怒江水系。通过在Illumina HiSeq 2500平台上对缺须盆唇鱼进行转录组测序（RNA-seq）分析，利用MicroSAtellite（MISA）微卫星识别工具对1～6个碱基重复、碱基数在10 bp以上的微卫星进行鉴定。结果表明，在缺须盆唇鱼转录组中，共发现分布在36764条Unigene上的30500个SSR位点，包含序列的SSR数量为18078，发生频率49.17%。获得的单纯SSR中，共有215种重复基元，其中单核苷酸重复基元类型数量最多，为88个，六碱基重复的SSR最少，其他的重复从二、三、四、五碱基开始，SSR的形成呈现递减规律。SSR位点的重复次数主要发生在6～10次和11～15次重复之间，发生频率分别为38.59%，36.02%。本研究第一次对缺须盆唇鱼的转录组数据进行测序鉴定，得到了数量较多的SSR标记，同时对得到的缺须盆唇鱼SSR数据特点进行归纳总结，本研究不仅提供了一个有价值的转录组资源，而且建立了一套SSR标记，可以为缺须盆唇鱼的基础研究、应用研究提供有效的分子标记。

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2、地方晒烟种质资源遗传多样性分析与评价

作者：李辉，李德芳，向世鹏

作者单位：1. 湖南文理学院生命与环境科学学院 2. 中国农业科学院麻类研究所 3. 湖南省烟草公司长沙市公司 4. 湖南农业大学农学院

出版日期：2019-11-6

为更好地收集、鉴定和保存地方晒烟品种,高效率地利用地方晒烟种质资源进行烟草品种选育。以67份地方晒烟品种的DNA为模板,利用筛选获得的25对SSR引物进行PCR扩增,采用二进制记录SSR分析结果,利用NTSY 2.1进行聚类分析,利用POPGENE 32.0进行遗传多样性分析。结果如下：(1) 25对SSR引物共检测到83个多态性位点,品种间的遗传相似系数变异范围为0.60～0.84。(2)遗传相似系数为0.62时,可以将67份晒烟品种分成3个类群,第Ⅰ类包括49份晒烟品种,第Ⅱ类包括13份晒烟品种,第Ⅲ类包括5份晒烟品种。(3)在晒烟资源中观测等位基因数的平均值、有效等位基因数的平均值、观测杂合度的平均值、期望杂合度的平均值分别为3.44个、2.762个、0.168、0.597。平均Nei’s基因多样性指数(H)为0.593,平均Shannon’s指数(I)为1.013。其中期望杂合度的平均值大于0.5。本研究对67份晒烟种质资源之间的遗传多样性较高,晒烟品种间的亲缘关系和品种的地理来源之间无明显相关性。

3、鲫鱼基因组DNA的扩增及在SSR分析中的验证

作者：武祥伟，罗荣，荣华，王晓雯，邓君明，孔令富，毕保良

作者单位：1. 云南农业大学动物科学技术学院 2. 云南省高原渔业资源保护与可持续利用重点实验室 3. 云南省临沧市镇康县水产技术推广站

出版日期：2019-11-8

本研究使用内切酶酶切初孵仔鱼的基因组DNA,酶切片段连接寡核苷酸接头,根据酶切位点序列与接头序列设计引物,采用PCR法扩增酶切片段,增加基因组DNA的数量。结果使用Taq I内切酶酶切鲫鱼基因组DNA,酶切片段连接寡核苷酸接头后PCR扩增,获得扩增产物集中于250～1 500 bp。以扩增的滇池高背鲫鱼基因组DNA为模板,PCR扩增滇池高背鲫鱼的微卫星分子标记(SSR)位点,获得预期的扩增片段,电泳图谱与对照组(未扩增的基因组DNA为PCR模板)无差异。本研究优化了鲫鱼基因组DNA的扩增方法,并可用于SSR分析中,为鱼类大规模遗传分析提供了技术支撑。

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4、基于SSR标记的38份欧洲报春种质资源遗传多样性分析

作者：周琳，杨柳燕，张永春，钱海忠，姜武

作者单位：1. 上海市农业科学院林木果树研究所上海市设施园艺技术重点实验室 2. 上海源怡种苗股份有限公司

出版日期：2019-11-7

为加快欧洲报春育种进程，本研究以庆典、丹诺雅、丹诺雅XL、丹妮莎、普利罗曼以及上海源怡种苗股份有限公司自主育种的春晖系列共38个欧报春品种为材料，利用24对SSR引物通过毛细管电泳检测法进行了欧洲报春遗传多样性和遗传关系分析。供试的24对SSR引物中11对引物稳定性和多态性较好，可用于遗传多样性和聚类分析。多态性信息指数为0.360 3～0.953 3，平均值为0.814 9。38个欧洲报春品种分别来源于6个不同品系，6个品系遗传距离都维持在较高水平，其中丹妮莎和普利曼罗间的遗传距离最小，上海源怡种苗股份有限公司自主育种的春晖系列与庆典的遗传距离最大，且春晖系列与其余5个品系的遗传距离均大于0.5。通过STRUCTURE分析发现6个群体中5个基因库的存在，且不同品系、不同花色的品种在基因库组成比例存在较大差异。本研究初步通过已有SSR标记开展欧洲报春遗传多样性分析，筛选出的标记可用于不同品系遗传距离的分析，但在不同品种DNA指纹图谱构建中还存在一定欠缺。后续将通过多种途径开展欧洲报春SSR标记的开发，以推进欧洲报春的育种进程以及新品种鉴定工作。

5、基于RNA-Seq技术的乒乓菊转录组分析

作者：周琳，蔡友铭，张永春，杨柳燕，姚建军，薛建平，叶燕萍，席祖路，于忠正

作者单位：1. 上海市农业科学院林木果树研究所上海市设施园艺技术重点实验室 2. 上海虹华园艺有限公司

出版日期：2019-11-7

为开展乒乓菊基因功能分析、表型差异研究、分子标记开发和遗传多样性等研究，本试验以‘绿乒乓’和‘粉乒乓’的花朵和叶片混合样品为试验材料，通过转录组测序分析，经de novo组装后获得133200条unigenes，进一步利用六大公共数据库对其进行注释，共注释64601条unigenes；并基于转录组数据开展SSR和SNP位点预测。结果表明：有25 462条unigenes参与了KEGG代谢通路，包括与花色、花期和药用成分代谢等相关的途径；共预测到1 444个转录因子，分属于35个家族，包括在植物的生长发育、生物合成、抗非生物和生物胁迫等方面发挥重要作用的AP2/ERF、C2C2、bHLH、WRKY等转录因子家族，以及LBD、MADS和TCP等与花色素苷代谢、花和根系发育、植物进化和发育密切相关的转录因子家族。此外，从13014条unigenes序列中搜索到14905个SSR位点；并分别从‘绿乒乓’和‘粉乒乓’中挖掘到1081925和1077818个SNP位点。本研究可为乒乓菊功能基因挖掘和分子标记开发提供基础。

6、木本油料植物光皮树叶片转录组测序与分析

作者：周宵，彭映辉，陈景震，蒋丽娟，李昌珠，姚茂华，向祖恒，张良波

作者单位：1. 中南林业科技大学生命科学与技术学院 2. 湖南省林业科学院生物能源研究所 3. 湖南省龙山县林业局 4. 北京林业大学生物科学与技术学院

出版日期：2019-11-7

用Illmina HiSeq测序平台技术，对光皮树叶片进行转录组测序分析，经组装获得36 839条unigene，与NR、String、Swissprot、KEGG等数据库进行比对注释，25 857条unigene得到注释，注释率为70.09%。光皮树叶片转录组unigene在Pfam、NR、String、Swissprot、KEGG、KOG、GO等数据库中被注释的基因数目分别为14 776、25 758、13 761、16 900、10 575、9 656、15 286。注释结果显示，光皮树与葡萄同源的序列最多，GO和KOG将其分成3大类别58个小组和3个功能类别；根据KEGG，13 114条unigene参与了33类代谢途径。采用软件MISA对unigene进行SSR检测，36 839条中有8 945条有SSR，共搜索到10 828个SSR位点，SSR长度范围在10～329 bp，平均长度为22.69 bp。SSR丰富度最高为二核苷酸，占所有SSR的58.07%，其次为一核苷酸和三核苷酸，分别占总SSR的27.02%和13.36%。本研究，通过光皮树叶片转录组测序，获得了大量基因序列，了解了光皮树基因的大致表达情况，同时为今后开发和利用光皮树、分子生物学标记、光皮树基因组的测序与组装提供了数据参考，也为后续光皮树在分子生物学研究、光皮树核心种质构建以及定向育种等领域提供了依据。

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7、基于全长转录组测序的金乌贼微卫星位点筛选与特征分析

作者：张金勇，何暮春，项子龙，柳淑芳，庄志猛

作者单位：1. 中国水产科学研究院黄海水产研究所农业农村部海洋渔业可持续发展重点实验室 2. 青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室 3. 南京农业大学无锡渔业学院 4. 中国海洋大学海洋生命学院 5. 上海海洋大学水产与生命学院

出版日期：2019-11-7

本研究在金乌贼Pacific Biosciences 单分子实时(Single-molecule real-time, SMRT)测序技术和Illumina RNA-Seq 技术转录组测序获得生物学数据信息的基础上，获得的177,951条Unigene，采用Micro Satellite (MISA)软件检测及分析其中的简单重复序列(Simple sequence repeat, SSR)位点信息。结果显示，在金乌贼转录组中共检测出161,327个SSR位点，分布在64,933条Unigene中，SSR位点发生频率为36.49%，出现频率为90.66%。其中，最主要的重复类型为单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸，分别占SSR总数的46.00%、39.93%和9.48%。SSR所包含的重复基元中，A/T是单核苷酸的优势重复基元，AT/AT和AC/GT是二核苷酸的优势重复基元类型。有66,004个重复基元长度≥20 bp，占SSR总数的40.91%，且其中含有低级重复基元(二、三核苷酸重复)SSR位点数量占优。以上结果表明，金乌贼转录组中SSR位点出现频率较高且类型丰富、多态性潜能较高，研究结果可为更好地开发金乌贼SSR分子标记、种质资源保护利用、遗传多样性评价和分子标记辅助育种等提供参考。

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8、西洋接骨木转录组SSR挖掘及荧光标记开发

作者：姚俊修，李善文，任飞，李庆华，刘学良，吴德军，燕丽萍

作者单位：1. 山东省林业科学研究院 2. 山东省林木遗传改良重点实验室 3. 山东农业大学

出版日期：2019-11-11

转录组SSR引物的开发为接骨木遗传多样性分析、遗传图谱构建和功能基因的挖掘提供丰富的遗传标记。以一株成年西洋接骨木的果实为实验材料，提取RNA后，采用Illumina HiSeq 2000高通量测序获得西洋接骨木转录组数据,共得到西洋接骨木转录组的257 975条Unigene，检测到64 148个SSR位点，分布于51 336条Unigene,SSR位点出现频率为24.87%(SSR位点数与总的Unigene数的比值)，其中，单核苷酸重复是主要类型，占总SSR的51.13%。其次是二、三核苷酸重复，分别占总SSR的38.63%和9.11%。A/T和AG/CT是单核酸和二核苷酸的优势重复基元。通过试验优化获得最优的两步荧光引物PCR扩增体系。加M13接头PCR扩增体系：10μL PCR体系中含DNA原液1μL,2×Mix 5μL,10μM引物各0.1μL，灭菌超纯水3.8μL；荧光引物PCR扩增体系：20μL PCR体系中含第一步扩增产物DNA原液2μL,2×Mix 10μL,10μM M13接头及反向引物各0.15μL，灭菌超纯水7.7μL。利用已筛选的100对荧光SSR引物对8个不同种接骨木个体进行SSR扩增，80对可扩增出条带，有效扩增率为80%,25对可成功扩增出多态性，多态性比率为31.25%，从25对具有多态性引物中选择14对多态性较好的引物对不同种接骨木进行遗传多样性分析，14对多态性引物共检测出67个等位基因(Na)，每位点3～7个，平均等位基因4.786个；每位点有效等位基因数(Ne)1.684～6.095个，平均有效等位基因数3.413个，观测杂合度(Ho)及期望杂合度(He)分别在0～0.875和0.406～0.836之间，平均值分别为0.313、0.664;Shannon多样性指数(I)在0.736～1.862之间，平均1.310。不同种接骨木具有较高的遗传多样性，25对具有多态性荧光SSR标记开发可为接骨木分子标记辅助育种、杂种优势预测等提供理论基础。

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9、利用EST-SSR标记评价羽扇豆属(Lupinus L.)遗传多样性

作者：张红岩，杨涛，刘荣，晋芳，张力科，于海天，胡锦国，杨峰，王栋，何玉华，宗绪晓

作者单位：1. 中国农业科学院作物科学研究所/国家农作物基因资源与基因改良重大科学工程 2. 青海大学 3. 全国农业技术推广服务中心 4.云南省农业科学院粮食作物研究所 5. USDA-ARS Western Regional Plant Introduction Station (WRPIS)

出版日期：2019-11-11

利用基于窄叶羽扇豆转录组开发并筛选出的95对多态性EST-SSR标记，对羽扇豆属的22个种133份资源进行全基因组扫描，初步探究羽扇豆属下种间的进化关系，分析来源于旧世界羽扇豆种间的遗传多样性，为羽扇豆优异资源的挖掘和创新利用提供理论依据。结果表明，用95对SSR标记共检测出1318个等位变异，每对标记平均检测出3～37个等位变异，平均为13.87个；多态性信息量(PIC)变化范围0.39～0.91，平均为0.75；基因多样性变化范围0.41～0.92，平均为0.78。基于邻接法(NJ)的系统发育初步探究了羽扇豆种间的进化关系，22个羽扇豆种分别来源于旧世界和新世界，与之前研究结果相对一致。聚类分析、群体结构分析和主成分分析结果均表明，来源于旧世界的7个羽扇豆种被划分为4个组群，各组群所包含的参试资源没有种间交叉重叠。

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10、花椒cpSSR标记开发及在种间、种内的通用性分析

作者：李思巧，韦伊，刘洪妤，张志东，张野，王丽华，刘玉林

作者单位：1. 西北农林科技大学林学院 2. 四川省林业科学研究院生物技术与良种研究所

出版日期：2019-11-12

叶绿体基因组为母系遗传，保守性高,因此叶绿体基因组中的简单序列重复(SSR)标记可在更高分类水平上进行种质资源鉴定和群体遗传结构分析。利用TRF软件和SSR Hunter软件相结合对花椒Zanthoxylum bungeanum叶绿体基因组中的SSR位点进行筛选。结果显示：花椒叶绿体基因组中共有144个SSR位点,位点间的平均分布距离为1 100.00 bp。基于检测软件设置参数,SSR重复类型主要集中在一、三核苷酸重复,二者占SSR位点总数的91.67%。此外,随机设计合成30对SSR引物对10份花椒种质、 5份竹叶花椒Zanthoxylum armatum种质和1份日本花椒Zanthoxylum piperitum种质进行PCR扩增检测,共筛选出10对多态性引物,其中单核苷酸重复位点的多态性高于多核苷酸重复位点。本研究开发的叶绿体SSR标记可有效区分花椒、竹叶花椒和日本花椒,但在花椒种内并未检测出多态性。表明花椒叶绿体基因组的SSR标记可用于花椒属不同种间的遗传多样性分析。

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